Enfermedad vascular en Enterocolitis Necrotizante

Febrero 2007

 

 

Oxidonítrico sintetasa endotelial en intestino humano resecado por enterocolitis necrotizante

 

Philip T. Nowicki , Donna A. Caniano, Sue Hammond , Peter J. Giannone, Gail E. Besner, Kristina M. Reber, y Craig A. Nankervis

 

From the Department of Pediatrics, Department of Surgery, The Ohio State University, Columbus, Ohio; Department of Laboratory Medicine, Children’s Hospital, Columbus, Ohio; and Center for Perinatal Research, Columbus Children’s Research Institute, Columbus, Ohio.

 

Journal of Pediatrics Enero 2007 ; Volumen 150 Nº 1 : 40-5

 

Traducción libre     Dr Gerardo Flores Henríquez     Pediatra Neonatólogo     Puerto Montt  Chile

 

 

Abreviaciones

 

ACh Acetylcholine  ; DSB Distal small bowel ; eNOS Endothelial nitric oxide synthase; iNOS  Inducible nitric oxide synthase; L-NNA L-NG-nitro-arginine; NEC Necrotizing enterocolitis ; NO Nitric oxide ; Pi  Inlet pressure ; Po Outlet pressure ; PSB Proximal small bowel ; SNAP  S-nitroso-n-acetylpenicillamine

 

 

Las arterias subserosas recogidas de intestino humano humano resecado por enterocolitis necrotizante NEC) muestran vasoconstricción basal que es parcialmente atenuada por bloqueo de receptores de endothelin ETA. Por otra parte, la concentración de endotelina tisular está aumentada en áreas de intestino resecadas por NEC que tenían injuria tisular. 1  Así, es evidente que la endotelina, un potente péptido vasoconstrictor, 2 participa en la patología vascular presente dentro de la microcirculación intestinal en NEC.  La resistencia vascular intestinal y así la tasa de flujo sanguíneo que atraviesa el intestino es determinada por un equilibrio momento a momento entre estímulos vasoconstrictores y vasodilatadores. En este contexto, es probable que la endotelina aumentada no es la base única para resistencia vascular aumentada de arterias subserosas en NEC, sino que el trastorno de otros sistemas de control vascular, particularmente sistemas vasodilatadores, puede también contribuir.

Un fuerte candidato para modulación de la vasodilatación es la isoforma endotelial de la óxido nítrico sintetasa (eNOS) . La eNOS derivada de óxido nítrico (NO) es el estímulo vasodilatador más potente presente en el intestino neonatal, según lo demostrado por vasoconstricción e isquemia observadas después de inhibición farmacológica de eNOS. 3 La expresión y actividad de eNOS pueden ser comprometidas por citokinas proinflamatorias, incluyendo factor de necrosis tumoral e interleukina-1β 4-6 que han sido recuperadas de intestino humano resecado por NEC.7 El compromiso de eNOS derivada de NO puede ocurrir dentro de la microvasculatura intestinal y contribuir a la fisiopatología microvascular. 

Los autores testearon la hipótesis que la expresión, actividad ó ambas de eNOS está comprometida en las arteriolas submucosas recogidas del intestino resecado por NEC. Las arteriolas fueron estudiadas en condiciones in vitro con sus respuestas hemodinámicas y la producción de NO como medida de actividad de eNOS.  Se usó inmunohistoquímica para evaluar la expresión de eNOS dentro de la microvasculatura intestinal intramural.

 

Métodos

 

Población del estudio

 

El proyecto fue aprobado por el comité de revisión institucional del Columbus Children’s Hospital y se obtuvo consentimiento de los padres. El grupo de NEC consistió en niños a los cuales se les realizó resección intestinal por NEC perforada. El grupo control consistió de niños a los cuales se les realizó resección intestinal por malformaciones congénitas del intestino. 

 

Toma de muestra tisular  y procesamiento

 

El intestino resecado por NEC fue revisado por un patólogo y las porciones no requeridas para un diagnóstico tisular fueron utilizadas para el estudio. Las muestras fueron divididas en 3 zonas: la zona 1 era tejido necrótico que rodeaba a sitio de perforación; la zona 2 era tejido > 0.5, pero < a 1.0 centímetros de áreas de necrosis visible; la zona 3 era el margen de resección que parecía macroscópicamente normal. Sólo el tejido de la zona 3 fue utilizado debido a que los experimentos fueron realizados exclusivamente en arteriolas de la submucosa; estos vasos están enteramente dentro de la microcirculación intestinal intramural y su localización submucosa hizo difícil su recuperación en tejido enfermo.  Las muestras de la zona 3 fueron divididas en 2 pedazos, 1 usado para análisis histológico y el otro para recolección arteriolar. Para lograr ésto último, el tejido fue fijado con el lado de mucosa abajo, y la serosa y capas musculares disecados lejos, revelando la submucosa. Las arteriolas de la submucosa fueron identificadas con un microscopio de disección como vasos de pared engrosada , una característica que las hizo fácilmente distinguibles de vénulas o linfáticos.  Cinco a 7 arteriolas fueron removidas y colocadas en el buffer Krebs con hielo (composición, en mmol/l: 118 NaCl, 4.5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgSO4, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 11 glucosa, 0.026 EDTA). El tejido conectivo adherente fue removido cuidadosamente. Los estudios fueron completados en el plazo de 2 horas de la recolección arteriolar. Los protocolos hemodinámicos fueron realizados simultáneamente en disposiciones microvasculares separadas. Los autores previamente confirmaron que la función arteriolar permanece completamente intacta dentro de este período de tiempo.8

 

Hemodinámica arteriolar  : Mecanismo

 

Las arteriolas de la submucosa fueron estudiadas usando un mecanismo apparatus microvascular in vitro.1,8  En breve, las arteriolas de submucosa fueron montadas entre micropipetas de vidrio situadas dentro de una cámara de Plexiglas colocado en la plataforma de un microscopio invertido y en línea con un sistema de imagen video (Living Systems, Burlington, Vt). Los vasos fueron perfundidos con buffer de Krebs por medio de bombas servo controladas colocadas en simetría de espejo a través de la arteriola. Los vasos fueron presurizados en ausencia de flujo fijando presiones de entrada (Pi) y de salida (Po) iguales (es decir, fijando el gradiente de presión a través del vaso en 0); alternativamente, el flujo fue directamente generado colocando la bomba proximal en modo manual y seleccionando la velocidad de flujo deseada. La cámara fue continuamente irrigada con buffer Krebs. Los puntos finales medidos incluyeron diámetro arteriolar (con calibradores video), presiones (con transductores de presión) y velocidad de flujo (con microflujómetro). 

 

Protococolos hemodinámicos 

 

En ambos protocolos hemodinámicos, las arteriolas fueron primero pretratadas con  N-( 3-aminometil - benzyl)  acetamidina (1400W), un inhibidor potente y altamente selectivo de la isoforma inducible de la óxido nítrico sintetasa (iNOS)9, considerando que NO derivado de iNOS está presente en intestino humano resecado por NEC.10  El primer protocolo hemodinámico fue realizado en condiciones de "no flujo" , con la arteriola presurizada en ausencia de flujo. El diámetro arteriolar de la línea de base fue primero determinado a una presión de 20 mm Hg y luego en un rango de presión de 10 a 40 mm Hg.  La presión luego fue restaurada a 20 mm Hg y 3 agentes fueron agregados a la solución buffer en sucesión, con lavado entre los agentes: acetilcolina (ACh, 1 nmol/l -1 umol/l), S-nitroso-n-acetilpenicilamina (SNAP, 1 umol/l), y papaverina (1 mmol/l). ACh estimula eNOS endógena, el SNAP es un donante exógeno de NO y la papaverina es un vasodilatador independiente de NO. Todas las arteriolas usadas en el primer protocolo fueron expuestas a todos los tratamientos en el protocolo.

En el segundo protocolo hemodinámico, realizado con una segunda arteriola, el diámetro de la línea de base fue primero medido en condiciones de no flujo a una presión de 20 mm Hg . El flujo fue luego generado cambiando la bomba de perfusión proximal de modo servo a modo manual y fijándola para generar velocidad de flujo exacto de 50 ó 100 l/min. La bomba distal fue dejada en modo servo para mantener Po en 5 mm Hg y Pi fluctuante como función de la resistencia arteriolar. El protocolo fue repetido después de la adición de L-NG-nitro-arginina (L-nna, 10 nmol/l), un análogo de la L-arginina que inhibe la actividad de eNOS, para confirmar que NO derivado de eNOS era responsable de cambios de flujo inducidos en la hemodinámica arteriolar. Todas las arteriolas usadas en el segundo protocolo fueron expuestas a todos los tratamientos que abarcaron el protocolo.

 

Ensayo de NO

 

Este protocolo fue realizado usando un tercer sistema de arteriolas que fueron pretratadas con 1400W, según lo descrito previamente. Los vasos fueron colocados en un plato plástico lleno de 500 ul de buffer Krebs aireado (21 % O2, 5 % CO2, N2 balance), calentado (37°C) (pH 7.4). La placa fue colocada en una incubadora humidificada (37°).  Después de 1 hora, se obtuvo una muestra de 50 uL del buffer para medición de NO y luego se agregó acetilcolina (10 nmol/l) . Una segunda muestra del buffer fue obtenida quince minutos más tarde. Las arteriolas fueron removidas, sumergidas en 500 uL de buffer de lisis (composición: 20 mmol/L HEPES, pH 7.4, 20 mmol/l de fosfato de glicerol, 2 mmol/l EGTA, 1 mmol/l DTT, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L de ortovanadato de Na, 100 mol/l  leupeptina, 10 nmol/l ácido okadaico,  1% triton-100,  10 % glicerol ,  10 g/ml aprotinina y 0.5  ng/ml  microcistina-LR) y homogeneizado en hielo con un politron por 5 minutos. El homogeinizado fue centrifugado, el sobrenadante fue recogido y la concentración de proteína fue determinada usando el método del ácido bicinconinico (Pierce, Rockford, Ill) .  El NO fue determinado en las muestras de buffer con un Sievers NO  Analyzer.  Los datos de NO fueron expresados como pmol/l/mg proteína. 

 

 

Análisis Histológico

 

El tejido fue fijado en formalina buffer al 10%,  se prepararon bloques de parafina y se cortaron secciones de 5 um. Algunas slides fueron utilizadas para análisis inmunohistoquímico (según lo descrito más abajo) y otras fueron teñidas con hematoxilina eosina para determinar injuria tisular. La injuria fue cuantificada por medio de un sistema de score establecido basado en las características histológicas de NEC; un score de 0 representaba una ausencia completa de lesión y un score de 6 reflejaba necrosis transmural.1 El examen histológico fue realizado por un miembro del estudio que fue cegado al origen del tejido. 

 

Inmunohistoquímica

 

La localización de eNOS dentro de la pared intestinal fue determinada con inmunohistoquímica según lo descrito previamente. 11 En resumen, slides de intestino fueron desparafinizados y rehidratados y la actividad de peroxidasa endógena fue extinguida con H2O2. Después de la digestión con tripsina, los cortes fueron incubadas con SuperBlock (ScyTek, Logan, Utah) y luego incubados durante la noche a 4°C con anticuerpo primario contra eNOS humana (1:200; BD Transduction Laboratories, San Jose, Calif). Los slides fueron lavados e incubados secuencialmente con UltraTek antipolyvalent antibody (ScyTek), horseradish peroxidase (ScyTek), chromagen (Dako, Carpentaria, Calif) y luego teñidos con hematoxilina y visualizados con microscopio de luz estándar.  Preparaciones (slides) de control negativo, consistentes de slides teñidas con solo anticuerpo secundario, fueron realizadas para cada muestra tisular.

 

Evaluación estadística

 

Los datos fueron analizados por un análisis de varianza bidireccional que utilizó grupo (NEC versus control) y condición (línea de base versus contra agonista ó flujo) como efectos principales.  t-tests post-hoc fueron realizados cuando el análisis de varianza F estadística era significativo. Un nivel de P < 0.05 fue aceptado como evidencia de significancia estadística para todos los análisis estadísticos. Todos los datos dados en el texto se presentan como promedio ± SD . 

 

 

Resultados

 

Los niños en el grupo de NEC (n = 8) experimentaron resección del intestino delgado por NEC perforado; en 6 casos, el tejido resecado era intestino delgado distal (DSB), aunque en 2 casos se resecó intestino delgado proximal (PSB).  Este grupo tenía una edad gestacional de 28 ± 2 semanas (rango, 26-31 semanas) y un peso de nacimiento de 980 ± 120 g (rango, 820-1210 g). Estos casos no fueron agrupados y no se observó perforación focal en ningún caso; ninguno de estos casos estaba incluído en el reporte previo de los autores.1  Todos los niños habían sido alimentados antes del desarrollo de NEC. Los niños en el grupo control (n = 5) experimentaron resección de intestino delgado por atresia congénita; en 3 casos, PSB fue resecado, aunque en 2 casos DSB fue removido. El grupo control tenía una edad gestacional de 37 ± 3 semanas (rango, 35-41 semanas) y un peso de nacimiento de 2780 ± 235 g (rango, 2575-3120 g); ninguno fue alimentado antes de la resección quirúrgica. 

El score de injuria tisular era comparable entre los grupos (grupo NEC, 1.4 ± 0.6; grupo control, 0.7 ± 0.5).  eNOS estaba presente en arteriolas de submucosa en intestino con NEC e intestino control (figura 1). Las arteriolas de la vellosidad también mostraron tinción acentuada eNOS en ambos, tejido con NEC y tejido control. 

 

 

Figura 1.-  eNOS staining in NEC (A) and control (B) tissues. Submucosal arterioles, identical to those used for in vitro hemodynamic assessment are shown. The arterioles consist of an endothelial layer, stained brown and representing eNOS, surrounded by several layers of vascular smooth muscle. Robust eNOS staining is present in both NEC and control arterioles (magnification, x400).

 

 

El diámetro arteriolar basal, medido a presión intravascular de 20 mm Hg en ambos protocolos hemodinámicos en ausencia de flujo, fue más pequeño en el grupo NEC (76 ± 9 um) que en el grupo control (100 ± 12 um; P < 0.05). Dentro de cada grupo, el diámetro arteriolar basal no era contingente al sitio anatómico (grupo NEC: PSB, 75 um, DSB, 76 ± 10 um; grupo control: PSB, 100 ± 12 um, DSB, 100 ± 12 um; ambos no significativos con t-test no pareado).  Las arteriolas de la submucosa del grupo NEC tenían diámetros más pequeños que las arteriolas del grupo control en el rango de presión de 10 a 40 mmHg; por otra parte, el diámetro de las arteriolas de NEC disminuyó cuando la presión fue aumentada 20 mmHg(Figura 2).

 

 

Figura 2. - Relationship between intravascular pressure and arteriolar diameter. Measurements were made in “no-flow” conditions to permit observation of the vessel response to pressure in the absence of the confounding dilatory effect of flow. Control arterioles are shown as open circles; NEC arterioles are shown as closed circles. Mean SD; n 8 (NEC), n 5 (control). *P .05 versus control. † P .05  versus pressure 20 mm Hg.

 

 

Las arteriolas del grupo control, pero no las del NEC,  demostraron vasodilatación significativa en respuesta a ACh; en contraste, las arteriolas de ambos grupos demostraron vasodilatación similar en respuesta al NO exógeno aportado vía SNAP o a la papaverina relajante directa del músculo liso (tabla 1).

 

Tabla 1.-  Effects of acetylcholine, S-nitroso-nacetylpenicillamine, and papaverine on submucosal arteriolar diameter

 

 

La aplicación de velocidades de flujo de 50 y 100 l/min causó aumentos significativos en el diámetro mayor que la línea de base de flujo cero en arteriolas del grupo control. En contraste, estas velocidades de flujo fallaron en aumentar significativamente el diámetro más alto que la línea de base de flujo cero en el grupo NEC (Figura 3).

 

 

Figura 3.-  Effects of flow on arteriolar diameter. Measurement at 0 flow was made with Pi and Po at set at 20 mm Hg. Thereafter, Po was reduced to 5 mm Hg, and the proximal pump was switched from servo to manual operation. Flow rates of 50 and 100 L/min were established. L-NNA was then added, and the protocol was repeated. Control arterioles are shown as open circles, and NEC arterioles are shown as closed circles; triangles represent data for each group after administration of L-NNA. Mean SD; n 8 (NEC), n 5 (control). * P .05 versus control. †P .05 versus zero flow. ‡P .05 for control arterioles, L-NNA versus preblockade.

 

 

La correlación entre la respuesta fisiológica de la dilatación inducida por flujo y la actividad eNOS fue confirmada por repetición de demanda de flujo después de aplicación de L-NNA, un análogo de L-arginina que inhibe la actividad de eNOS. La L-NNA atenuó significativamente la dilatación inducida por flujo en arteriolas del grupo control, pero no tuvo ningún efecto en arteriolas de grupo  NEC (Figura 3).  En el tercer protocolo, el uso de ACh (10 nmol/l)  aumentó la concentración de NO dentro del medio acondicionado desde 12.4 ± 2.1 a 19.5 ± 1.3 pmol/L/uL/mg proteína en arteriolas del grupo control. El cambio observado en el medio en arteriolas de grupo NEC fue significativamente menor,  desde 11.4 ± 1.1 a 13.2 ± 1.0 pmol/L/uL/mg proteína (P < 0.05). 

 

Discusión

 

La discusión de estos resultados debe comenzar con el reconocimiento que los niños en el grupo control eran más maduros y más grandes al nacer que los niños en el grupo de NEC.  Dos de 8 muestras de resección en el grupo NEC fueron PSB, mientras que 3 de 5 muestras en el grupo control fueron de esta región. Aunque se reportó comparación estadística entre los grupos, las comparaciones pueden no ser apropiadas en base a diferencias demográficas y anatómicas en los grupos. Las diferencias de desarrollo en la expresión ó actividad de eNOS en los grupos (prematuro versus cercano a término) o el sitio anatómico del cual las arteriolas fueron recogidas (PSB contra DSB) pueden haber afectado los resultados. 

Los cambios en la expresión y actividad de eNOS ocurren durante el desarrollo fetal y postnatal precoz. Así, la expresión 12 y actividad13 de eNOS  aumentan en la vasculatura pulmonar en función de la edad fetal y luego postnatal. La eNOS pulmonar también llega a estar desacoplada durante la vida postnatal precoz 14 (es decir, la configuración de la enzima cambia de modo que ella produce sobre todo anión superóxido más bien que NO15). Este desacoplamiento, sin embargo, no compromete el efecto vasodilatador de la estimulación eNOS en el período postnatal, 14  a tal grado como el H2O2, producto de dismutación del anión superóxido, que también es un vasodilatador. 16  De hecho, el desacoplamiento eNOS dentro de la vasculatura pulmonar parece ser una adaptación molecular normal que es parte de la transición total de la vasculatura pulmonar al medioambiente extrauterino respirando aire.14 

En la arteria mesentérica porcina, la expresión eNOS aumenta entre la vida fetal tardía  (0.95 de gestación) y la vida postnatal precoz ;  por otra parte, ocurre un aumento dramático en el primer día postnatal después del inicio de alimentación.17  Estudios de la expresión ó actividad de eNOS dentro de la vasculatura intestinal durante el desarrollo fetal no han sido realizados.

 

Los autores afirman que las diferencias de desarrollo en la expresión ó función de eNOS no eran las únicas responsables de las diferencias observadas en los grupos de estudio por 2 razones. Primero, la expresión de eNOS con inmunohistoquímica fue similar en ambos grupos. En segundo lugar, el estímulo de eNOS, sea por medios químicos o mecánicos, no pudo generar vasodilatación en arteriolas que demostraron posteriormente relajación a NO exógeno (vía SNAP) ó papaverina. La paradoja entre expresión eNOS existente y función eNOS ausente se ha descrito solamente en condiciones patológicas (ej, aterosclerosis y diabetes mellitus18).

Los mecanismos posibles para esta circunstancia incluyen modificación post-transducción ausente de eNOS que previene su paso a célula endotelial , 19 presencia inadecuada de L-arginina, sustrato de eNOS, 20 y desacoplamiento eNOS.15    La falta aparente de NO podría también reflejar su desaparición por reacción química con anión superóxido para formar peroxinitrito.21  Altos niveles de anión superóxido podrían estar presentes en intestino con NEC debido a la presencia de citokinas proinflamatorias ó episodios previos de isquemia-reperfusión. 22

Las diferencias hemodinámicas regionales entre PSB y DSB existen en el recién nacido, debido a que ambas, las velocidades de flujo de la línea base y postprandial son mayores en el intestino proximal.23    Puede esperarse que los diámetros de arteriolas submucosas sean mayores en el intestino proximal, lo cual puede confundir la comparación entre arteriolas recogidas del intestino delgado proximal y arteriolas recogidas de intestino delgado distal. Esta circunstancia no estaba presente en las arteriolas submucosas que los autores  estudiaron. El diámetro arteriolar basal, obtenido a una presión intravascular uniforme, no fue diferente dentro de cualquier grupo de estudio como función del sitio anatómico de la resección intestinal. También, el diámetro máximo observado después de administración de papaverina fue similar en todas las arteriolas de ambos grupos. Los autores concluyen que el diámetro basal más pequeño observado en arteriolas de NEC reflejaba la vasoconstricción causada por fisiología aberrante, la cual incluía una pérdida relativa de tono vasodilatador causada por una pérdida de actividad de eNOS, y no era consiguiente a diferencias anatómicas en la dimensión arteriolar.

Este estudio indica que la actividad de eNOS y la producción de NO están disminuídas en arteriolas de NEC. En contraste, Ford y cols 10  reportaron expresión de iNOS y producción de NO  aumentadas en NEC humana. Estas isoformas de NOS , sin embargo, son únicas en su localización y función.  La eNOSestá localizada en células endoteliales situadas en perfecta yuxtaposición a las células vasculares del músculo liso que dictan la dimensión vascular y así la hemodinamia .

La eNOS libera cantidades picomolares de NO dentro de la membrana plasmática que reviste la superficie del lumen de la célula endothelial .19 iNOS cuando se expresa dentro del intestino, produce cantidades mucho más grandes de NO (micromoles) y está presente en una variedad de tipos celulares.10  El NO derivado de iNOS no sustituye el NO derivado de eNOS en la regulación vascular. De hecho, la pérdida de actividad de eNOS, y así la regulación vascular, ha sido asociada con injuria tisular indirecta.24  Es ciertamente concebible que ambos eventos (es decir, reducción de actividad de eNOS y aumento en actividad de iNOS)  ocurren simultáneamente.

El objetivo de este proyecto fue determinar si los efectos vasculares de eNOS estaban comprometidos en arteriolas submucosas recogidas de regiones de muestras resecadas por NEC que exhibían mínima injuria tisular. Esta fisiopatología parece estar presente. Sin embargo, las observaciones hechas en zona 3 pueden no ser completamente representativas de la fisiopatología precoz de NEC. Ocurre rápida extensión de la enfermedad al tejido adyacente en NEC,  como es evidente por la extensión de neumatosis intestinal.25  Las áreas de estudio fueron absolutamente próximas a áreas de enfermedad activa, sugiriendo que estos especímenes de zona 3 pudieron proporcionar información acerca de la patogenia de la enfermedad en NEC, a pesar de la naturaleza in vitro de los estudios vasculares.

Es improbable que eventos vasculares sean los factores primarios o de inicio en la patogenia de NEC.22,26  La histopatología de NEC demuestra evidencia de isquemia precedente y la inflamación, aunque presente, no está ccerca del nivel característico de enfermedad inflamatoria intestinal.25  Los autores proponen que ocurre isquemia microvascular durante el curso de la patogenia de NEC. Estos resultados, que demuestran respuestas aberrantes dentro de las arteriolas de la submucosa, complementan la observación previa de los autores que las arterias subserosas recogidas de áreas de intestino que muestran lesión tisular moderada por NEC tenían vasoconstricción inducida por endotelina.1  Así, ahora hay evidencia de fisiopatología microvascular en 2 niveles de la microcirculación intestinal, el sitio probable de isquemia relevante para patogenia de NEC.22,26 Caplan y cols 27  previamente reportaron que el factor activante de plaqueta, un potente vasoconstrictor, está elevado en NEC humana. Los autores especulan que estos efectos contribuyen a la generación de lesión tisular en NEC, probablemente por comprometer la entrega de O2 microvascular.

 

Referencias

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